腎穿病理常用的特殊染色技術(shù)

①光鏡檢查     ②電鏡檢查     ③免疫熒光檢查

1、光鏡檢查（中性甲醛固定）：

①HE染色     ②免疫組化     ③特殊染色     ④分子檢測

2、電鏡檢查（戊二醛固定）：透射電鏡檢查

3、免疫熒光檢查（丙酮固定）：免疫熒光

1、腎穿標(biāo)本常做的染色：

①常規(guī)染色：HE染色

②特殊染色：PASM、PAS、Masson三色

③免疫熒光染色（直接法）：IgG、IgA、IgM、C3、C1q、Fg

2、根據(jù)診斷需要選做的染色：

①特殊染色：剛果紅（氧化/不氧化）、色素染色、脂肪染色

②免疫熒光：（直接法）K、λ、IgG1-4

（間接法）乙肝、膠原三項、C4d、PLA2R、BKV

根據(jù)檢查項目（光鏡檢查、電鏡檢查、免疫熒光檢查）不同需要分別送3份標(biāo)本：光鏡標(biāo)本、免疫熒光標(biāo)本、電鏡標(biāo)本

1、腎穿長度：＞12mm為宜

2、腎小球的判別：

①髓質(zhì)呈暗紅色

②皮質(zhì)顏色稍淺淡，模糊的小紅點

③若無腎小球，可要求再次送檢

3、取標(biāo)本要注意不得將組織夾斷或夾扁，盡量維持原有的形狀

4、鋒利的一次性刀片

5、鑷子要專用，不得混用

1、熒光：OCT/ZEUS熒光運輸液（-20℃或4℃）

（IF）小球數(shù)目＞5個

2、光鏡：10%中性福爾馬林（pH7.0-7.2，室溫）

（LM）小球數(shù)目＞10個

3、電鏡：2.5%戊二醛（4℃）

（EM）小球數(shù)目＞2個

注意：腎組織要保持濕潤，絕對不可以干涸！床邊快速進行切割、固定！

1、最常用的脫水劑

2、脫水能力強

3、使組織硬化

4、與水在任何濃度下互溶

5、與二甲苯互溶

組織收縮的原因：①高濃度乙醇     ②脫水時間     ③溫度

如何改善：低→高，70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→無水乙醇，控制溫度，不超過40℃

1、二甲苯作為透明劑，既溶于酒精又能溶解石蠟的特性，但不溶于水且揮發(fā)性強，具有一定的毒性

2、石蠟的熔點：58-60℃

3、應(yīng)選擇不含雜質(zhì)、質(zhì)量好的石蠟，否則影響切片質(zhì)量（切片有刀痕，難以薄切）

4、浸蠟時間不宜過久，浸蠟溫度不宜過高。否則會造成組織脆硬，切片易破碎

1、切出完整切片要做到：①兩條組織靠攏     ②組織平整     ③貼平蠟面

2、切片的厚薄直接影響對結(jié)果的判讀

厚度: ①Masson染色 3 μm

②PASM染色 1 ~2 um

③PAS染色 3 μm

④HE染色 3 μm

⑤剛果紅染色 4~5 μm

切片薄才能清晰觀察到腎小球基底膜是否發(fā)生改變

1、PASM(Periodic acid--silver methenamine)染色步驟：

①切片脫蠟至水，1%高碘酸氧化15min，蒸餾水洗

②8%鉻酸水溶液30min，蒸餾水洗

③1%偏重亞硫酸鈉處理1分鐘，水洗，再用蒸餾水洗3～4次

④浸入加熱至60℃的六胺銀工作液 ，反應(yīng)20min，蒸餾水洗終止反應(yīng)

⑤0.2%氯化金水溶液2min，蒸餾水洗

⑥3%硫代硫酸鈉水溶液2min，水洗5分鐘

⑦天青石藍(lán)- Mayer蘇木素染色各5min，水洗，返藍(lán)

⑧立春紅酸性品紅液反應(yīng)1分鐘，1%磷鉬酸液分化3-5分鐘

⑨常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片

2、PASM染色結(jié)果---核心染色

腎小球囊壁、腎小球基底膜和腎小管基底膜呈黑色，免疫復(fù)合物呈紅色，胞核呈藍(lán)色

3、六胺銀(PASM)染色注意事項

①六胺銀染色是進行性銀浸染，不可逆

②溫度：達到60℃

③鏡下控制反應(yīng)時間

④用高碘酸和鉻酸雙重氧化，可使基底膜著色深，基底膜的結(jié)構(gòu)更加清晰

⑤用六胺銀工作液浸染切片時，適宜的染色溫度為60℃，溫度低，基底膜不易著色；溫度高，銀胺液出現(xiàn)渾濁，玻片和玻璃染色瓶起銀鏡反應(yīng)

1、麗春紅酸性品紅-苯胺藍(lán)法(Masson三色法)染色步驟：

       ①切片脫蠟至水，浸入Bouin氏液一晚，流水沖洗5min，蒸餾水洗

       ②天青石藍(lán)溶液處理5min，水洗

③Mayer蘇木素染色各5min，水洗

④1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗后返藍(lán)10min

⑤麗春紅酸性品紅液染色10min，蒸餾水稍水洗

⑥1%磷鉬酸處理約5min

⑦苯胺藍(lán)（或亮綠）溶液染色5min，1%冰醋酸處理1min

⑧常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片

2、Masson三色染色結(jié)果

腎小球囊壁、腎小球和腎小管基底膜、膠原纖維呈藍(lán)色，免疫復(fù)合物呈紅色，細(xì)胞核藍(lán)紫色

3、Masson三色染色注意事項

①前處理推薦：標(biāo)本 Bouin液 常規(guī)脫水包埋切片→Masson染色（效果佳）

固定

10%甲醛常規(guī)脫水包埋切片 Bouin液 Masson染色（效果佳）

補充固定

10%甲醛常規(guī)脫水包埋切片→Masson染色（效果不佳）

②

蘇木素	細(xì)胞核的顏色
Weigert鐵蘇木素	黑褐色
天青石藍(lán)--Mayer蘇木素	藍(lán)黑色

Weigert氏鐵蘇木素：

甲液：蘇木素 1g 無水酒精 100ml

乙液：30%三氯化鐵液 4ml 蒸餾水 100ml 純鹽酸 1ml

分甲、乙兩液需分瓶盛放，不宜配制過多，臨用前將兩液等份混合使用，而不宜預(yù)先混合，否則易氧化沉淀而逐漸失去其染色力

③1%磷鉬酸水溶液的作用

a.分化作用：時間要短，鏡下控制，膠原纖維被分化成無色或淡紅色，肌纖維、纖維素鮮紅色

B.媒染作用：使膠原纖維與大分子染料的苯胺藍(lán)液較易結(jié)合

④苯胺藍(lán)液后用1%冰醋酸處理，目的是除去附于細(xì)胞漿內(nèi)的藍(lán)色，使染色鮮艷和清晰

⑤苯胺藍(lán)的染色時間一定要控制好，不能過染，否則會遮蓋了肌纖維的顏色，造成對比不清晰

⑥如果不用苯胺藍(lán)進行復(fù)染，可用亮綠復(fù)染,但是亮綠容易褪色

1、PAS染色步驟：

①切片脫蠟至水，1%高碘酸氧化20min

②蒸餾水反復(fù)充分水洗，無色品紅試劑避光反應(yīng)20min

③1%偏重亞硫酸鈉處理2min；流水沖洗5～10min

④用蘇木素淺染胞核；水洗

⑤常規(guī)脫水透明，封片

2、PAS染色結(jié)果

腎小球囊壁、腎小球和腎小管基底膜、腎小球系膜基質(zhì)呈紫紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色

3、PAS染色注意事項

①高碘酸的氧化時間

a.真菌染色： 10min

b.腎基底膜染色：20min

②無色品紅的配制：偏重亞硫酸鈉的質(zhì)量要保證（不能潮解，要確認(rèn)試劑中二氧化硫的氣味要足夠濃）

③偏重亞硫酸鈉在染色作用：洗去無色品紅試劑，再用水洗，目的是終止染色，避免背景紅染

④使用方法：無色品紅液應(yīng)置于4℃冰箱保存，用前恢復(fù)室溫。無色品紅液可反復(fù)使用多次，至溶液出現(xiàn)淡紅色時才棄用。切片在用無色品紅染色前，要用蒸餾水反復(fù)沖洗，避免有自來水帶入無色品紅試劑，造成無色品紅試劑變紅，染色力下降。

⑤反應(yīng)時間：（避光）

a.無色品紅試劑染色宜在室溫20℃～25℃進行

b.夏季室溫高，可縮短染色時間至20分鐘

c.冬季室溫較低，可延長染色時間至30分鐘

1、淀粉樣變性腎病是以淀粉樣蛋白沉積為特點的代謝性疾病

2、剛果紅染色可顯示淀粉樣蛋白

3、淀粉樣蛋白分為：

①AL蛋白（淀粉樣輕鏈蛋白）---- 漿細(xì)胞所分泌的免疫球蛋白的輕鏈

       ②AA蛋白（淀粉樣相隨蛋白）-----來自血漿中的和免疫球蛋白不相關(guān)的蛋白質(zhì)

4、淀粉樣蛋白剛果紅染色方法

①、組織固定于10%甲醛液，常規(guī)脫水包埋

②、切片厚4μm，常規(guī)脫蠟至水

③、甲醇剛果紅液染10min，傾去余液

④、堿性乙醇分化，約2s～5s，水洗2次后于鏡下控制至合適為度

⑤、流水沖洗5min

⑥、Mayer蘇木精淺染胞核

⑦、流水沖洗10min

⑧、常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固

5、淀粉樣蛋白染色注意事項

①甲醇剛果紅法染色結(jié)果顏色鮮艷，結(jié)果不易褪色

②甲醇剛果紅染液因其甲醇成分，在滴染時染液容易擴散，可采用浸染方式

③凡是用剛果紅染淀粉樣蛋白，也把甲狀腺膠質(zhì)、彈力纖維等染成紅色，應(yīng)注意區(qū)分

④用堿性乙醇分化時要掌握恰當(dāng)，若分化不足，膠原纖維也著紅色；分化過度，淀粉樣蛋白也可脫色

⑤如脫色過度，可將切片水洗后由第3步開始重染。因此分化時需要在鏡下觀察

⑥剛果紅染色

A片：常規(guī)方法進行剛果紅染色

B片：用酸化高錳酸鉀氧化后再進行剛果紅染色

           ⑦原發(fā)性淀粉樣變性腎病

              AL蛋白變性（A、B片陽性）：骨髓瘤伴發(fā)的淀粉樣變性腎病

             局限性淀粉樣變性腎病

             AA蛋白變性（A片陽性B片陰性）：繼發(fā)性淀粉樣變性腎病

             地中海家族性淀粉樣變性腎病

注：建議配合視頻學(xué)習(xí)，效果更佳。

回放更新時間：6月6日，回放視頻觀看方式【關(guān)注“達科為醫(yī)療”公眾號，點擊達學(xué)堂菜單—課后回放進入學(xué)習(xí)】

病理·達學(xué)堂

2020.05.22